Раствор солей металлов (РСМ) готовили в виде их смеси в равных пропорциях NiCl2, CrCl3, CоCl2, CuCl2, ZnCl2, MnCl2, готовили в концентрации 0,01 мг/мл в забуференном физиологическом растворе. Сывороточный альбумин человека в концентрации 2 г/л добавлялся к этому раствору непосредственно перед использованием.
В качестве негативных контролей использовались образцы нестимулированной цельной крови, инкубированной с ЗФР и ЧСА. Образцы крови пациентов разделяли в 4 пробирки (12×75 мм), использовали 100 мкл крови на тест: 2 стимулятора и 2 негативных контроля активации.
Фенотипирование клеток
Для фенотипирования клеток кровь брали натощак из локтевой вены в пробирки с гепарином (20 Ед/мл). После добавления к 100 мкл гепаринизированной цельной крови в пробирки по 2,5 мкл жидкость фрагментов протезов (ЖФП) и раствора солей металлов (РСМ), исследуемые образцы ресуспендировали и культивировали в течение 15 мин при 37 °С в термостате. После чего добавляли 2,5 мкл раствора моноклональных антител CD203c-РЕ и CD63-FITC, перемешивали на вортексе и инкубировали 15 минут при комнатной температуре, затем добавляли раствор, лизирующий эритроциты, и инкубировали при 37 °С еще 10 мин, добавляли 500 мкл буферного раствора и фенотипировали.
Исследование проводили на проточном цитометре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc., США) с использованием моноклональных антител CD203c-РЕ и CD63-FITC. Использовали моноклональные антитела производства "Invitrogen Corporation", "Life Technologies Corporation", "Beckman Coulter",США.
Статистический анализ
Результаты ПЦ-анализа анализировались вслепую, лаборант-оператор не знал о диагнозах пациентов. Наоборот, диагностика аллергии проводилась, прежде чем результаты проточной цитометрии (ПЦ) становились известны.
Расчеты показателей проводились в программе Statistica 10,0. Данные, подчиняющиеся закону нормального распределения (Shapiro-Wilkp>0,05), обрабатывались с помощью критерия T-test, непараметрические данные - с помощью критериев Mann-Whitney UTest (M-U), парного теста Wilcoxon Matched Pairs Test c указанием уровня достоверности расчета (p). Корреляция показателей оценивалась с помощью непараметрического теста Spearman Rank Order Correlations с указанием степени и уровня достоверности расчета (p). Для оценки значимости критериев применялся ROC-анализ с указанием чувствительности, специфичности, уровня значимости (AUC), достоверности (p). ROC-анализ проводили в программе MedCalc.
О качестве метода диагностики судили по экспертной шкале, которая базируется на величине AUC и имеет несколько градаций: площадь AUC, равная 0,9-1 - отличное качество модели, 0,8-0,9 - очень хорошее, 0,7-0,8 - хорошее, 0,6-0,7 - среднее, 0,5-0,6 - неудовлетворительное.
Результаты исследования
Аппликационные пробы
В опытную группу (n=22) были включены пациенты с положительными аппликационными пробами (АП) на соли металлов. У 6 (27,3%) пациентов АП были резко положительными, у 4 (18,2%) - сильноположительными и у 5 (22,7%) пациентов положительными к раствору соли NiCl2 (3%). К раствору соли CrCl3 (3%) по результатам проведения аппликационных проб (АП) у 5 (22,7%) пациентов были отмечены резкоположительные реакции, у 3 (13,63%) пациентов - сильноположительные и у 3 (13,63%) пациентов положительные реакции.
Кожная гиперчувствительность к раствору соли CoCl2(1%) у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) выявлена по аппликационным пробам (АП) у 8 пациентов, из них у 4 (18,2%) пациентов реакция была резкоположительной, у 2 (9%) пациентов сильноположительной и у 2 (9%) пациентов положительной.
При этом результаты проведения аппликационных проб (АП) были одновременно положительными на NiCl2 (3%) и CrCl3 (3%) - у 7 (31,8%) пациентов, на NiCl2 (3%) и CоCl2 (1%) - у 5 (22,7%) пациентов; на CrCl3 (3%) и CоCl2 (1%) - у 2 (9%) пациентов, а на NiCl2 (3%), CrCl3 (3%) и CоCl2 (1%) - у 2 (9%) пациентов.
Тест активации базофилов у пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ)
У пациентов с непереносимостью стоматологических материалов (НСМ) показано увеличение количества CD63+CD203c+ базофилов с использованием в качестве индуктора их активации раствор солей металлов (РСМ) и жидкость фрагментов протезов (ЖФП).
Процент аллерген-активированных базофилов определяли как процент базофилов, экспрессирующих маркер, минус его значение внестимулированной контрольной пробе. Диагностическую значимость оценивали при помощи метода ROC-анализа (анализа кривой Receiver-Operatorcharacteristic). Устанавливали оптимальную точку (критерий) отсечения (cut-ofvalue) для изучаемых признаков и определяли площадь под кривой (AUC или areaundercurve) для сравнения диагностической значимости выбранных признаков при установлении диагноза.
По результатам тестов рассчитывали оптимальный порог процента прироста CD63+CD203c+ базофилов при оптимальных значениях чувствительности (Se) и специфичности (Sp) для различных индукторов их активации.
Наилучшее соотношение чувствительности и специфичности наблюдалось для жидкости фрагментов протезов (ЖФП-А), где AUC был равен 0,86. Этот параметр указывает на высокую диагностическую значимость этого лабораторного теста (рис. 1).
Нет комментариев